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        1. 【返回列表頁】

          貨號:Cat. No. T90805-1   Size: 1ml
          貨號:Cat. No. T90805-9   Size: 9ml 
          —— 產品介紹
              本產品是在本公司第二代即用型PCR試劑盒G2.0的基礎上改良而來,內含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應緩沖液、PCR增強劑、上樣染料等所有PCR所需要的成分,用戶只需加入模板和引物即可進行PCR反應,具有廣泛的用途。
          —— 產品特色
          1.  擴增效率和靈敏度更高。
          2.  使用改良型PCR染料,與熒光PCR兼容,此染料功能類似溴酚藍,擴增結束后無需添加上樣液及電泳指示染料即可直接電泳檢測。
          3.  方便——用戶只需準備模板和引物既可以進行PCR實驗。
          4.  快捷——操作步驟已經最大限度地簡化,能減少污染,降低實驗誤差。
          5.  本產品A型含電泳染料, PCR反應液可直接上樣電泳,進一步簡化了操作。
          6.  產物可直接用于T載體克隆,不需要額外的加A反應。
          7.  染料單獨提供,方便客戶組合。
           —— 操作步驟
              以30 uL的標準PCR反應體系為例:在一干凈的PCR管中,加入下列成分:
          PCR MagicMix3.0
          15ul
          DNA模板(自備)
           
          哺乳動物基因組DNA
          0.5-1 ug
          酵母基因組DNA
          5-500 ng
          細菌基因組DNA
          0.5-50 ng
          質粒DNA
          5-500 pg
          PCR回收片段
          1-100 pg
          PCR引物(自備)
          10 pmol each
          補水到
          30ul
              放入PCR儀中進行PCR,結束后取5-10 uL直接上樣電泳(A型產品不需要額外再加DNA上樣液),紅色染料電泳速度相當于50 bp DNA片段。B型產品用戶按照1.5mL PCR MagicMix 3.0加入60 uL專用染料的比例將60 uL專用染料加入到1.5 mL PCR MagicMix 3.0中。
          注意:
          1.如果反應體系不是30 uL,各成分需要等按比例增加或減少。
          2.如果DNA模板中有PCR不明抑制物(植物、土壤和血液等DNA樣品常含此類抑制物),可以在PCR體系中加入1/10的PCR抑制物清除劑,可能會對PCR有幫助。
          ——— 保存條件
              低溫運輸,-20℃保存,有效期1年。
          —— 注意事項
              本產品分A和B兩種:
          A型產品:PCR MagicMix 3.0中直接加入了專用染料;
          B型產品:PCR MagicMix 3.0中沒有加入專用染料,染料單獨提供。 
          —— 相關專業資料
          PCR反應的影響因素:
          1、變性溫度與時間:模板變性溫度是決定PCR反應中雙鏈DNA解鏈的溫度,達不到變性溫度就不會產生單鏈DNA模板,PCR也就不會啟動。變性溫度低則變性不完全,DNA雙鏈會很快復性,因而減少產量。變性溫度太高,又會影響酶的活性。一般情況下可設為94℃20~30秒,高溫時間應盡量縮短,以保持耐熱DNA聚合酶的活力,最高變性溫度不宜超過95℃。 
          2、退火溫度與時間:退火溫度決定PCR特異性與產量。溫度高特異性強,但過高則引物不能與模板牢固結合,DNA擴增效率下降;溫度低產量高,但過低可造成引物與模板錯配,非特異性產物增加。合適的退火溫度一般在45~68℃之間。設置特定反應的最適退火溫度,可根據引物的(G+C)%含量進行推測,一般實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃,退火時間一般為30~60秒,足以使引物與模板之間完全結合,長時間退火沒有必要。 
          3、延伸溫度與時間:PCR反應的延伸溫度一般選擇在70~75℃之間,延伸時間根據所用聚合酶擴增速度和擴增片段大小設定,如同樣擴增2 Kb片段,若使用Taq酶只需1分鐘,使用Pfu酶則應設定2分鐘以上。延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現,時間太短則可能得不到擴增產物或得到一些短的非特異性片段。 
          4、循環次數:可根據模板DNA的量、擴增片段的大小和擴增產物的下一步應用等因素,設定20-40個循環。循環次數太少,擴增量不足,如果循環次數太多,錯配幾率會增加,非特異性背景嚴重。所以,在保證產物得率前提下,應盡量減少循環次數。 
          5、酶量:50μL反應體系可用0.5-5 U酶,酶量的選擇與模板DNA的量、擴增片段大小等有關,酶量過多易發生非特異性反應,而且可能增加突變的機率,尤其在進行高保真擴增時,應盡量減少酶量,但酶量過少時反應性能下降。
          6、模板:模板可以是單鏈DNA,也可以是雙鏈DNA,質粒DNA的擴增效率略低于線狀DNA。模板加量一般不需太多,不超過1μg為宜,因為加量過多可能導致非特異性擴增增加,但是要考慮模板中靶序列的含量。例如,使用基因組為模板擴增單拷貝或低拷貝靶序列,就需要適當加大模板用量。
          7、引物:引物與模板配對的長度應至少為17個核苷酸,最高不宜超過30個核苷酸,最佳長度為20~24個核苷酸,如需插入酶切位點,應在酶切位點5’端多加幾個堿基,有利于酶切。引物的(G+C)%含量組成應均勻,盡量避免含有相同的堿基多聚體。兩個引物中(G+C)%含量應盡量相似。引物內部應避免形成明顯的次級結構,如發夾結構。兩個引物之間不應發生互補,特別是在引物3’端。如果可能,引物3’端最好富有GC,這樣退火后有利于引物3’端的延伸。人工合成的引物最好經驗色譜層析純化或PAGE純化,以除去未能合成至全長的短鏈等雜質。引物的終濃度一般為0.1-2μM左右,濃度太高會導致非特異性擴增,太低則擴增產物太少。

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